1476年、当時有名な男娼だった17歳のヤコポ・サルタレリにモデルとして連絡を取ったことで同性愛者として匿名で告発されている。他の3人の若い男性とともに同性愛者として容疑がかけられたが、証拠不十分で放免されている。しかし以後、レオナルドと3人の男性はフィレンツェの "夜の士官"(ルネサンス期の風紀取締り役のようなもの)から監視を受ける。 レオナルドの伝記を書いたロバート・ペインは、レオナルドが男性女性を同様に愛することができたと確信していたようである(娼婦との付き合いも彼のメモに残されている)。彼のノートの一部分を抜粋して彼の性的嗜好を断ずるのは容易いが、現時点で確たる結論は出ていない。